Amarengo

Articles and news

LC-MS/MS i det kliniska labbet: styrkor, applikationer, utmaningar

historiskt sett hade masspektrometri varit av begränsad användning i kliniska laboratorier; kombinationen av atmosfärstryck jonisering (API) metoder med tandem masspektrometri har dock öppnat denna teknik för den kliniska laboratoriearenan. Nyheten med denna teknik verkar likna den för immunanalyser på 1970-talet och polymeraskedjereaktion, eller PCR, på 1980-talet.1 Tandem masspektrometri hittade sin väg in i kliniska laboratorier i början av 1990-talet, med analys av acylkarnitiner och aminosyror från neonatala blodfläckar. Under det senaste decenniet har vätskekromatografi tandem masspektrometri (LC-MS/MS) spelat en allt viktigare roll i klinisk analys. Det är vanligt nu att hitta det i laboratorier med applikationer för endokrinologi, toxikologi, farmakologi och terapeutisk läkemedelsövervakning. När priserna för grundläggande LC-MS/MS-system minskar kommer fler kliniska laboratorier att våga sig in i denna teknik.

översikt över LC-MS / MS

masspektrometri mäter mass-till-laddningsförhållandet (m/z) för en molekyl, som har joniserats, och dess fragmentjoner. Ett masspektrum är handlingen av m / z kontra jonintensiteten eller jonöverflöd.2. en tandemmasspektrometer har två massselektiva anordningar (quadrupoles) anordnade i en serie som väljer prekursorjonen (av en viss m/z) för respektive analyt, som sedan riktas in i en kollisionscell där ett mycket lågt flöde av en kollisionsgas är ansvarig för upplösningen av prekursorjonerna i flera produktjoner. Den andra quadrupolen placerad bakom kollisionscellen används för att skanna efter produktjoner som bildas enligt deras respektive m/z-förhållande.

kollisionscellen i sig kan representera en liten quadrupol; därför kan termen triple quadrupol masspektrometer användas synonymt. För kvantifiering med LC-MS / MS, efter LC-separation av respektive analyt, införs molekylerna i masspektrometern via API, vilket möjliggör jonbildning. Det finns två primära joniseringstekniker, elektrosprayjonisering (ESI) och kemisk jonisering av atmosfärstryck (APCI). Användningen av ESI är främst för analys av laddade arter; medan APCI används för oladdade eller svåra att ladda arter. ESI är en” mjuk ” jonisering (mycket låg energi) process, som vanligtvis ger den intakta modermolekylen med en eller flera laddningar.

styrkor av LC-MS / MS

specificitet: val av prekursorjonen med den första quadrupolen och produktfragmentjonen med den andra quadrupolen av tandemmasspektrometern kan uppvisa mycket specifik detektion för en given molekyl.

brett användningsområde: i motsats till GC/MS är tillämpningen av LC-MS/MS inte begränsad till flyktiga molekyler (vanligtvis med molekylvikter under 500 Da). Eftersom de flesta biologiskt aktiva molekyler är polära, termolabila och icke-flyktiga, är LC-MS/MS bättre inriktad på detektering av sådana molekyler. Vidare är provberedning vanligtvis enkel och kräver inte derivatiseringstekniker. LC-MS/MS-analyser är generellt optimerade för kortare körtider; därför kan mycket högre provgenomströmning realiseras jämfört med GC / MS.

flexibilitet: nya analyser kan vanligtvis utvecklas i hus (”hembrygga”) med hög grad av flexibilitet och inom en kort tid, förutsatt att en omfattande analysvalidering utförs.

överflöd av information: en enda analytisk LC-MS / MS-körning, på grund av den snabba jonvalelektroniken, multiparametriska, kvasiparallella analyser med masspektrometern, kan producera ett stort antal kvantitativa eller kvalitativa resultat.

tillämpningsområden

nyfödda screening: den initiala razzia av LC-MS / MS i den kliniska arenan var dess tillämpning på nyfödda screening av medfödda fel i ämnesomsättningen.3 för närvarande används i många industrialiserade länder LC-MS / MS i rutinmässig nyfödd screening för medfödda fel i ämnesomsättningen. För närvarande omfattar nyfödda screening i torkade blodfläckar mer än 30 sjukdomar, som inkluderar organiska acidemier, aminoacidopatier och defekter av fettsyraoxidation. Dessutom har tandemmasspektrometri använts för att screena för andra metaboliter såsom urinoligosackarider,4 sulfatid,5 mycket långkedjiga fettsyror,6 långkedjiga gallsyror,7 metylmalonsyra,8 och för undersökning av porfyri 9 och screening för patienter med risk för ärftliga störningar i purin-och pyrimidinmetabolism.10

terapeutisk läkemedelsövervakning: Utvecklingen av det immunsuppressiva sirolimus (rapamycin) för förebyggande av organavstötningar efter transplantation var den viktigaste stimulansen bakom införandet av LC-MS/MS i det kliniska laboratoriet. LC-MS / MS-metoder finns tillgängliga för samtidig bestämning av takrolimus, sirolumus och cyklosporin.11 LC-MS / MS-metoder finns tillgängliga för en mängd olika läkemedelsklasser såsom cytotoxiska läkemedel,12 antiretrovirala läkemedel,13 tricykliska antidepressiva medel,14 antikonvulsiva medel,15 antiepileptika 16 … . När drivkraften mot mer individualiserad läkemedelsdosering fortsätter kommer LC-MS/MS-analys av dessa läkemedelsklasser att bli mer och mer rutinmässig.

droger-of-abuse och smärta-management testning: GC/MS är fortfarande den mest använda tekniken för toxikologi testning; dock, LC-MS/MS vinner mark i det området på grund av enkel provberedning, inget krav på derivatisering, och kortare körtider. Direkt drogscreening från urin har rapporterats17 och metoder finns tillgängliga för multidrugpaneler för screening av missbruk,18 och för bekräftelse av bensodiazepiner,19 mätningen av många läkemedel såsom buprenorfin och dess metaboliter, 20 amfetamin,21 opioider.22

endokrinologi och steroidtestning: Radioimmunoassay och enzymimmunoassays var de viktigaste teknikerna för mätning av steroider i de kliniska laboratorierna. Immunanalyser lider av många begränsningar såsom bristen på specificitet, begränsat dynamiskt omfång och matriseffekter. Tillkomsten av LC-MS / MS ses som en innovativ analytisk teknik som är tillämplig på ett stort antal analyser i endokrinologilaboratoriet, främst kvantifiering av olika steroider. Analysen av 25 (OH) vitamin D3-och D2-nivåer med LC-MS/MS har fått fart,23 och LC-MS/MS-metoder har utvecklats för en mängd olika steroider såsom testosteron, aldosteron, kortisol, progesteron, östriol… .24

utmaningar

LC-MS/MS-tekniken måste övervinna vissa utmaningar innan man hoppar från en specialiserad, tekniskt komplex teknik till vanliga kliniska laboratorietester. Även om instrumenteringen har minskat i pris och komplexitet kvarstår utmaningar som att utveckla analyser, standardisera analyser över hela linjen och utbilda och upprätthålla högkvalificerad teknisk personal.

metodutveckling och validering: Majoriteten av LC-MS / MS-metoder som används i det kliniska laboratoriet kan placeras under den laboratorieutvecklade testkategorin, eftersom de ”bryggdes hemma.”Laboratorierna som implementerar denna teknik förväntas utveckla testet och genomföra en grundlig validering innan de sätter dessa tester i rutinmässig användning. Laboratorierna förväntas förbereda sig i hus eller förvärva kommersiellt högkvalitativa standarder, deutererade interna standarder och kvalitetskontrollmaterial. Ansträngningar pågår från tillverkningsföretagen för att presentera Food and Drug Administration – (FDA -) godkända testsatser för användning av det kliniska laboratoriet. Den första sådan kit var Waters MassTrak immunsuppressiva kit (Waters, Milford, MA) som FDA-cleared för kvantifiering av immunsuppressiva takrolimus (FK506; Prograf) i lever – och njurtransplanterade patienters helblodsprover som ett hjälpmedel i hanteringen av takrolimus terapi. Som liknande kit blir FDA rensas, och som mer kommersiella kalibratorer, kvalitetskontrollmaterial, och standarder blir tillgängliga, dessa kommer att lindra några av de utmaningar utbredd användning av LC-MS/MS i kliniska laboratorier.

standardisering: fördelen med mycket specifika mätningar kompenseras av mellan laboratorieskillnader mellan olika LC-MS / MS-metoder eftersom majoriteten är ” hembryggt.”Bristen på standardisering och harmonisering i masspektrometri är en stor utmaning som måste övervinnas för mer utbredd användning av denna teknik i de kliniska laboratorierna. Ansträngningar pågår för att standardisera vissa LC-MS / MS-metoder som testosteron och vitamin D. Det endokrina samhället och Centers for Disease Control and Prevention kom ut tidigt 2010 med ett konsensus uttalande för att säkerställa mycket noggrann testosterontestning som kommer att resultera i förbättrad diagnos, behandling och förebyggande av sjukdom genom användning av standardiserade analyser.25 denna ansträngning syftar till att uppnå mycket noggrann och pålitlig testosteronmätning med både LC-MS/MS och immunanalyser. I Storbritannien finns ett externt kompetensprovningssystem för vitamin-D-analys — benämnt DEQAS, för vitamin D externt kvalitetssäkringssystem-tillgängligt. Det övergripande syftet med DEQAS är att säkerställa analytisk tillförlitlighet av 25 hydroxyvitamin D (25OHD) och 1,25 dihydroxyvitamin D (1,25(OH)2D) analyser.

teknisk expertis: Utbildning och underhåll av högkvalificerad personal behövs inte bara för metodutveckling och validering utan också för den dagliga driften. Doktorandnivå talang kan behövas för att genomföra testerna och för felsökning men inte för masspektrometerns dagliga verksamhet.

laboratorietekniker med masspektrometrikompetens är mer än kapabla att hantera vardagliga operationer; att hitta sådan expertis är dock utmanande. För att få laboratoriepersonal igång med masspektrometri har American Association for Clinical Chemistry etablerat ett nytt nio-kurscertifikatprogram för att använda tandem masspektrometri i det kliniska laboratoriet.

Charbel Abou-Diwan, PhD
, är en klinisk kemi postdoktor vid Institutionen för patologi vid Emory University School of Medicine, Atlanta GA.

  1. Vogeser M, Seger C. Ett decennium av HPLC-MS / MS i det rutinmässiga kliniska laboratoriet-mål för vidare utveckling. Clin Biochem. 2008;41(9):649-662.
  2. Dooley KC. Tandem masspektrometri i det kliniska kemilaboratoriet. Clin Biochem. 2003;36(6):471-481.
  3. Rashed MS, et al. Screening blodfläckar för medfödda fel i ämnesomsättningen genom elektrospray tandem masspektrometri med en mikroplatta batchprocess och en datoralgoritm för automatiserad flaggning av onormala profiler. Clin Chem. 1997; 43(7):1129-1141.
  4. Rozaklis T, et al. Bestämning av oligosackarider i Pompes sjukdom genom elektrospray jonisering tandem masspektrometri. Clin Chem. 2002;48(1):131-139.
  5. Whitfield PD, et al. Karakterisering av urin sulfatider i metakromatisk leukodystrofi med användning av elektrospray jonisering-tandem masspektrometri. Mol Genet Metab. 2001;73(1):30-37.
  6. Johnson DW. Alkyldimetylaminoetylesterjodider för förbättrad analys av fettsyror genom elektrospray jonisering tandem masspektrometri. Snabb Commun Mass Spectrom. 2000;14(21):2019-2024.
  7. Johnson DW, et al. Snabb och kvantitativ analys av okonjugerade C (27) gallsyror i plasma-och blodprover genom tandemmasspektrometri. J Lipid Res. 2001; 42 (1): 9-16.
  8. Magera MJ, et al. Metylmalonsyra mätt i plasma och urin genom stabil isotoputspädning och elektrospray tandem masspektrometri. Clin Chem. 2000; 46(11):1804-1810.
  9. Ford RE, et al. Kvantitativ mätning av porfobilinogen i urin genom stabil isotoputspädning vätskekromatografi-tandemmasspektrometri. Clin Chem. 2001;47(9):1627-1632.
  10. Ito T, et al. Snabb screening av högriskpatienter för störningar i purin-och pyrimidinmetabolism med hjälp av HPLC-electrospray tandem masspektrometri av flytande urin eller urindränkta filterpappersremsor. Clin Chem. 2000;46(4):445-452.
  11. Volosov A, Napoli KL, Soldin SJ. Samtidig enkel och snabb kvantifiering av tre stora immunsuppressiva medel genom vätskekromatografi—tandemmasspektrometri. Clin Biochem. 2001;34(4):285-290.
  12. Lennard L. terapeutisk läkemedelsövervakning av cytotoxiska läkemedel. Br J Clin Pharmacol. 2001; 52 Suppl 1: 75S-87S.
  13. Gu J, Soldin SJ. Modifiering av tandemmasspektrometrisk metod för att möjliggöra samtidig kvantifiering av 17 anti-HIV-läkemedel som inkluderar atazanavir och tipranavir. Clin Chem Acta. 2007;378(1-2):222-224.
  14. Kollroser M, Schober C. Samtidig bestämning av sju tricykliska antidepressiva läkemedel i human plasma genom direktinsprutning HPLC-APCI-MS-MS med en jonfångsdetektor. Där Drog Monit. 2002;24(4):537-544.
  15. Oertel R, et al. Samtidig bestämning av tre anticon-vulsanter med användning av hydrofil interaktion LC-MS. J Sep Sci. 2009;32(2):238-243.
  16. Bardin S, et al. Bestämning av fria nivåer av fenytoin i human plasma genom vätskekromatografi/tandemmasspektrometri. J av Pharm Biomed Anal. 2000;23(2-3):573-579.
  17. Fitzgerald RL, Rivera JD, Herold DA. Brett spektrum läkemedelsidentifiering direkt från urin, med användning av vätskekromatografi-tandem masspektrometri. Clin Chem. 1999; 45 (8 Pt 1): 1224-1234.
  18. Eichhorst JC, et al. Drog av missbruk testa av tandem masspektrometri: en snabb, enkel metod för att ersätta immunoassays. Clin Biochem. 2009;42(15):1531-1542.
  19. Glover SJ, Allen kr. Mätning av bensodiazepiner i urinen genom vätskekromatografi-tandemmasspektrometri: bekräftelse av prover som screenats genom immunanalys. Ann Clin Biochem. 2010;47(2):111-117.
  20. Polettini A, Huestis MA, Simultaneous determination of buprenorphine, norbuprenorphine, and buprenorphine-glucuronide in plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr. B: Biomedical Sciences and Applications, 2001. 754(2): p. 447-459.
  21. Wu TY, Fuh MR. Determination of amphetamine, methamphetamine, 3,4-methylenedioxyamphetamine, 3,4-methylenedioxyethylamphetamine, and 3,4-methylenedioxymethamphetamine in urine by online solid-phase extraction and ion-pairing liquid chromatography with detection by electrospray tandem mass spectrometry. Snabb Commun Mass Spectrom. 2005;19(6):775-780.
  22. Musshoff F, et al. Ett automatiserat och fullständigt validerat LC-MS / MS-förfarande för samtidig bestämning av 11 opioider som används i palliativ vård, med 5 av deras metaboliter. J Masspektrom. 2006;41(5):633-640.
  23. El-Khoury JM, Reineks EZ, Wang S. framsteg av vätskekromatografi-masspektrometri vid mätning av vitamin D-metaboliter och analoger. Clin Biochem. 2011;44(1):66-76.
  24. Kushnir MM, et al. Vätskekromatografi tandem masspektrometri för analys av steroider i kliniska laboratorier. Clin Biochem. 2011;44(1):77-88.
  25. Rosner W, Vesper H. mot excellens i testosterontestning: ett konsensus uttalande. J Clin Endocrinol Metab. 2010;95(10):4542-4548.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.