Amarengo

Articles and news

LC-MS / MS în laboratorul clinic: puncte forte, aplicații, provocări

din punct de vedere istoric, spectrometria de masă a fost de utilizare limitată în laboratoarele clinice; cu toate acestea, combinația metodelor de ionizare a presiunii atmosferice (API) cu spectrometria de masă tandem a deschis această tehnologie în arena laboratorului clinic. Noutatea acestei tehnologii pare a fi similară cu cea a imunotestelor din anii 1970 și a reacției în lanț a polimerazei, sau PCR, în anii 1980.1 spectrometria de masă Tandem și-a găsit drumul în laboratoarele clinice la începutul anilor 1990, cu analiza acilcarnitinelor și a aminoacizilor din petele de sânge neonatale. În ultimul deceniu, spectrometria de masă în tandem cu cromatografie lichidă (LC-MS/MS) a jucat un rol din ce în ce mai important în analiza clinică. Este obișnuit acum să-l găsim în laboratoare cu aplicații pentru endocrinologie, toxicologie, farmacologie și monitorizare terapeutică a medicamentelor. Pe măsură ce prețurile pentru sistemele de bază LC-MS/MS scad, mai multe laboratoare clinice se vor aventura în această tehnologie.

Prezentare generală a LC-MS/MS

spectrometria de masă măsoară raportul masă-încărcare (m/z) al unei molecule, care a fost ionizată, și ionii săi de fragment. Un spectru de masă este complotul m / z versus intensitatea ionilor sau abundența ionilor.2 un spectrometru de masă tandem are două dispozitive selective de masă (patrupoli) dispuse într-o serie care selectează ionul precursor (al unui anumit m/z) al analitului respectiv, care este apoi direcționat într-o celulă de coliziune unde un flux foarte scăzut al unui gaz de coliziune este responsabil pentru dezintegrarea ionilor precursori în mai mulți ioni de produs. Al doilea quadrupol poziționat în spatele celulei de coliziune este utilizat pentru a scana ionii de produs care se formează în funcție de raportul lor m/z respectiv.

celula de coliziune în sine poate reprezenta un mic patrupol; prin urmare, termenul spectrometru de masă triplu quadrupol poate fi utilizat sinonim. Pentru cuantificarea cu LC-MS / MS, după separarea LC a analitului respectiv, moleculele sunt introduse în spectrometrul de masă prin API, ceea ce permite formarea ionilor. Există două tehnici primare de ionizare, ionizarea electrospray (ESI) și ionizarea chimică sub presiune atmosferică (APCI). Utilizarea ESI este în primul rând pentru analiza speciilor încărcate; în timp ce APCI este utilizat pentru speciile neîncărcate sau dificil de încărcat. ESI este un proces de ionizare „moale” (energie foarte scăzută), care produce de obicei molecula părinte intactă cu una sau mai multe sarcini.

concentrațiile LC-MS / MS

specificitate: selectarea ionului precursor cu primul quadrupol și a ionului fragment de produs cu al doilea quadrupol de către spectrometrul de masă tandem poate prezenta o detecție foarte specifică pentru o moleculă dată.

gamă largă de aplicații: spre deosebire de GC/MS, aplicarea LC-MS/MS nu se limitează la molecule volatile (de obicei cu greutăți moleculare sub 500 Da). Deoarece majoritatea moleculelor biologic active sunt polare, termolabile și nevolatile, LC-MS/MS este mai bine orientat spre detectarea unor astfel de molecule. Mai mult, pregătirea probelor este de obicei simplă și nu necesită tehnici de derivatizare. Testele LC-MS / MS sunt, în general, optimizate pentru perioade de rulare mai scurte; prin urmare, se poate realiza un randament mult mai mare al eșantionului în comparație cu GC/MS.

flexibilitate: noile teste pot fi dezvoltate de obicei în casă („Home brew”) cu un grad ridicat de flexibilitate și într-un timp scurt, cu condiția efectuării unei validări complete a testului.

abundență de informații: o singură rulare analitică LC-MS/MS, datorită electronicii rapide de selecție a ionilor, analize multi-parametrice, cvasi-paralele cu spectrometrul de masă, poate produce un număr mare de rezultate cantitative sau calitative.

domenii de aplicare

screening-ul nou-născutului: incursiunea inițială a LC-MS/MS în arena clinică a fost aplicarea sa la screeningul nou-născut al erorilor înnăscute ale metabolismului.3 în prezent, în multe țări industrializate, LC-MS/MS este utilizat în screeningul de rutină al nou-născutului pentru erorile înnăscute ale metabolismului. În prezent, screeningul nou-născutului în pete de sânge uscate cuprinde mai mult de 30 de boli, care includ acidemii organice, aminoacidopatii și defecte ale oxidării acizilor grași. În plus,spectrometria de masă tandem a fost utilizată pentru a detecta alți metaboliți,cum ar fi oligozaharidele urinare,4 sulfatide,5 acizi grași cu lanț foarte lung,6 acizi biliari cu lanț lung, 7 acid metilmalonic, 8 și pentru investigarea porfiriei9 și screening pentru pacienții cu risc de tulburări moștenite ale metabolismului purinei și pirimidinei.10

monitorizarea terapeutică a medicamentelor: Dezvoltarea Sirolimusului imunosupresor (rapamicină) pentru prevenirea respingerii organelor după transplant a fost stimulul major din spatele introducerii LC-MS/MS în laboratorul clinic. Sunt disponibile metode LC-MS / MS pentru determinarea simultană a tacrolimus, sirolumus și ciclosporină.11 metode LC-MS / MS sunt disponibile pentru o varietate de clase de medicamente,cum ar fi medicamente citotoxice,12 medicamente antiretrovirale,13 antidepresive triciclice,14 anticonvulsivante, 15 antiepileptice16 … . Pe măsură ce tendința către o dozare mai individualizată a medicamentelor continuă, analiza LC-MS/MS a acestor clase de medicamente va deveni din ce în ce mai rutină.

testarea drogurilor de abuz și a gestionării durerii: GC/MS este în continuare cea mai utilizată tehnică pentru testarea toxicologică; cu toate acestea, LC-MS/MS câștigă teren în acea zonă datorită pregătirii simple a eșantionului, fără cerințe de derivatizare și timpi de rulare mai scurți. A fost raportată depistarea directă a medicamentelor din urină17 și sunt disponibile metode pentru panouri multidrog pentru depistarea drogurilor de abuz, 18 și pentru confirmarea benzodiazepinelor, 19 măsurarea a numeroase medicamente, cum ar fi buprenorfina și metaboliții săi,20 amfetamine,21 opioide.22

Endocrinologie și testarea steroizilor: testul radioimunologic și imunotestele enzimatice au fost principalele tehnici de măsurare a steroizilor în laboratoarele clinice. Imunotestele suferă de multe limitări, cum ar fi lipsa specificității, intervalul dinamic limitat și efectele matricei. Apariția LC-MS / MS este privită ca o tehnologie analitică inovatoare aplicabilă unui număr mare de analize în laboratorul de endocrinologie, în principal cuantificarea diferiților steroizi. Analiza nivelurilor de 25 (OH) de vitamina D3 și D2 prin LC-MS/MS a câștigat impuls,au fost dezvoltate metode 23 și LC-MS/MS pentru o varietate de steroizi, cum ar fi testosteronul, aldosteronul, cortizolul, progesteronul, estriolul… .24

provocări

tehnologia LC-MS / MS trebuie să depășească anumite provocări înainte de a face saltul de la o tehnică specializată, complexă din punct de vedere tehnic, la testarea clinică de laborator. Deși instrumentele au scăzut în ceea ce privește prețul și complexitatea, rămân provocări precum dezvoltarea testelor, standardizarea testelor la nivel general și instruirea și menținerea personalului tehnic cu înaltă calificare.

dezvoltarea și validarea metodei: Majoritatea metodelor LC-MS / MS utilizate în laboratorul clinic pot fi plasate sub categoria de testare dezvoltată în laborator, deoarece au fost „preparate acasă.”Se așteaptă ca laboratoarele care implementează această tehnologie să dezvolte testul și să efectueze o validare amănunțită înainte de a pune aceste teste în uz de rutină. Se așteaptă ca laboratoarele să se pregătească în casă sau să achiziționeze standarde comerciale de înaltă calitate, standarde interne deuterate și materiale de control al calității. Sunt în curs de desfășurare eforturi din partea companiilor producătoare pentru a prezenta kituri de testare aprobate de Food and Drug Administration- (FDA-) pentru utilizarea de către laboratorul clinic. Primul astfel de kit a fost kitul de imunosupresoare Waters MassTrak (Waters, Milford, MA) care a fost aprobat de FDA pentru cuantificarea tacrolimusului imunosupresor (FK506; Prograf) în probele de sânge integral ale pacienților cu transplant hepatic și renal, ca ajutor în gestionarea terapiei cu tacrolimus. Pe măsură ce kiturile similare devin aprobate de FDA și pe măsură ce mai multe calibratoare comerciale, materiale de control al calității și standarde devin disponibile, acestea vor ajuta la atenuarea unora dintre provocările utilizării pe scară largă a LC-MS/MS în laboratoarele clinice.

standardizare: avantajul măsurătorilor foarte specifice este compensat de diferențele de laborator dintre diferitele metode LC-MS/MS, deoarece majoritatea sunt „preparate acasă.”Lipsa standardizării și armonizării spectrometriei de masă este o provocare majoră care trebuie depășită pentru o utilizare mai răspândită a acestei tehnologii în laboratoarele clinice. Sunt în curs de desfășurare eforturi pentru standardizarea anumitor metode LC-MS / MS, cum ar fi testosteronul și vitamina D. Societatea endocrină și Centrele pentru Controlul și Prevenirea Bolilor au ieșit la începutul anului 2010 cu o declarație de consens pentru a asigura testarea testosteronului extrem de precisă, care va duce la îmbunătățirea diagnosticului, tratamentului și prevenirii bolilor prin utilizarea testelor standardizate.25 acest efort vizează obținerea unei măsurători foarte precise și fiabile a testosteronului utilizând atât LC-MS/MS, cât și imunoteste. În Marea Britanie, este disponibilă o schemă externă de testare a competenței pentru analiza vitaminei D-denumită DEQAS, pentru schema externă de asigurare a calității vitaminei D. Scopul general al DEQAS este de a asigura fiabilitatea analitică a testelor de 25 hidroxivitamină D (25ohd) și 1,25 dihidroxivitamină d (1,25(OH)2D).

expertiză tehnică: Instruirea și menținerea personalului cu înaltă calificare este necesară nu doar pentru dezvoltarea și validarea metodelor, ci și pentru funcționarea zilnică. Talentul la nivel de doctorat ar putea fi necesar pentru implementarea testelor și pentru depanare, dar nu și pentru operațiunile zilnice ale spectrometrului de masă.

tehnologii de laborator cu expertiză în spectrometrie de masă sunt mai mult decât capabili să gestioneze operațiunile de zi cu zi; cu toate acestea, găsirea unei astfel de expertize este o provocare. Pentru a aduce personalul de laborator la curent cu spectrometria de masă, Asociația Americană pentru Chimie Clinică a stabilit un nou program de certificat cu nouă cursuri în utilizarea spectrometriei de masă tandem în laboratorul clinic.

Charbel Abou-Diwan, PhD
, este un post-doctorat în chimie clinică la Departamentul de patologie de la școala de Medicină a Universității Emory, Atlanta Ga.

  1. Vogeser M, Seger C. Un deceniu de HPLC-MS/MS în laboratorul clinic de rutină–obiective pentru evoluții ulterioare. Clin Biochem. 2008;41(9):649-662.
  2. Dooley KC. Spectrometrie de masă Tandem în laboratorul de chimie clinică. Clin Biochem. 2003;36(6):471-481.
  3. Rashed MS și colab. Depistarea petelor de sânge pentru erorile înnăscute ale metabolismului prin spectrometrie de masă tandem electrospray cu un proces de lot microplacă și un algoritm computerizat pentru marcarea automată a profilurilor anormale. Clin Chem. 1997; 43(7):1129-1141.
  4. Rozaklis T, și colab. Determinarea oligozaharidelor în boala Pompe prin spectrometrie de masă tandem de ionizare electrospray. Clin Chem. 2002;48(1):131-139.
  5. Whitfield PD, și colab. Caracterizarea sulfatidelor urinare în leucodistrofia metacromatică folosind ionizare electrospray-spectrometrie de masă tandem. Mol Genet Metab. 2001;73(1):30-37.
  6. Johnson DW. Ioduri de ester alchildimetilaminoetil pentru analiza îmbunătățită a acizilor grași prin spectrometrie de masă tandem de ionizare electrospray. Spectrom De Masă Rapid Commun. 2000;14(21):2019-2024.
  7. Johnson DW, și colab. Analiza rapidă și cantitativă a acizilor biliari C(27) neconjugați în probele de plasmă și sânge prin spectrometrie de masă tandem. J Lipide Res. 2001; 42 (1):9-16.
  8. Magera MJ și colab. Acid metilmalonic măsurat în plasmă și urină prin diluție izotopică stabilă și spectrometrie de masă Tandem electrospray. Clin Chem. 2000; 46(11):1804-1810.
  9. Ford RE și colab. Măsurarea cantitativă a porfobilinogenului în urină prin cromatografie lichidă cu diluție izotopică stabilă-spectrometrie de masă tandem. Clin Chem. 2001;47(9):1627-1632.
  10. Ito T, și colab. Screening Rapid al pacienților cu risc crescut pentru tulburări ale metabolismului purinei și pirimidinei utilizând spectrometria de masă tandem HPLC-electrospray a urinei lichide sau a benzilor de hârtie de filtru îmbibate în urină. Clin Chem. 2000;46(4):445-452.
  11. Volosov A, Napoli KL, Soldin SJ. Cuantificarea simultană simplă și rapidă a trei imunosupresoare majore prin cromatografie lichidă—spectrometrie de masă tandem. Clin Biochem. 2001;34(4):285-290.
  12. Lennard L. monitorizarea terapeutică a medicamentelor citotoxice. Br J Clin Pharmacol. 2001; 52 Suppl 1: 75S-87S.
  13. Gu J, Soldin SJ. Modificarea metodei spectrometrice de masă tandem pentru a permite cuantificarea simultană a 17 medicamente anti-HIV care includ atazanavir și tipranavir. Clin Chem Acta. 2007;378(1-2):222-224.
  14. Kollroser M, Schober C. Determinarea simultană a șapte medicamente antidepresive triciclice în plasma umană prin injecție directă HPLC-APCI-MS-MS cu un detector de capcane ionice. Medicamentul Monit. 2002;24(4):537-544.
  15. Oertel R, și colab. Determinarea simultană a trei anticon-vulsanți utilizând interacțiunea hidrofilă LC-MS. J Sep Sci. 2009;32(2):238-243.
  16. Bardin S, și colab. Determinarea nivelurilor libere de fenitoină în plasma umană prin cromatografie lichidă / spectrometrie de masă tandem. J de Pharm Biomed Anal. 2000;23(2-3):573-579.
  17. Fitzgerald RL, Rivera JD, Herold DA. Identificarea medicamentelor cu spectru larg direct din urină, folosind cromatografie lichidă-spectrometrie de masă tandem. Clin Chem. 1999; 45(8 Pt 1):1224-1234.
  18. Eichhorst JC, și colab. Medicamente de testare a abuzului prin spectrometrie de masă tandem: o metodă rapidă și simplă de înlocuire a imunotestelor. Clin Biochem. 2009;42(15):1531-1542.
  19. Glover SJ, Allen KR. Măsurarea benzodiazepinelor în urină prin cromatografie lichidă-spectrometrie de masă tandem: Confirmarea probelor examinate prin imunotest. Ann Clin Biochem. 2010;47(2):111-117.
  20. Polettini A, Huestis MA, Simultaneous determination of buprenorphine, norbuprenorphine, and buprenorphine-glucuronide in plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr. B: Biomedical Sciences and Applications, 2001. 754(2): p. 447-459.
  21. Wu TY, Fuh MR. Determination of amphetamine, methamphetamine, 3,4-methylenedioxyamphetamine, 3,4-methylenedioxyethylamphetamine, and 3,4-methylenedioxymethamphetamine in urine by online solid-phase extraction and ion-pairing liquid chromatography with detection by electrospray tandem mass spectrometry. Spectrom De Masă Rapid Commun. 2005;19(6):775-780.
  22. Musshoff F, și colab. O procedură LC-MS/MS automatizată și complet validată pentru determinarea simultană a 11 opioide utilizate în îngrijirea paliativă, cu 5 dintre metaboliții lor. J Spectrom De Masă. 2006;41(5):633-640.
  23. El-Khoury JM, Reineks EZ, Wang S. progresul cromatografiei lichide-spectrometrie de masă în măsurarea metaboliților și analogilor vitaminei D. Clin Biochem. 2011;44(1):66-76.
  24. Kushnir MM și colab. Cromatografie lichidă spectrometrie de masă tandem pentru analiza steroizilor în laboratoarele clinice. Clin Biochem. 2011;44(1):77-88.
  25. Rosner W, Vesper H. spre excelență în testarea testosteronului: o declarație de consens. J Clin Endocrinol Metab. 2010;95(10):4542-4548.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.