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LC-MS / MS nel laboratorio clinico: punti di forza, applicazioni ,sfide

Storicamente, la spettrometria di massa era stata di uso limitato nei laboratori clinici; tuttavia, la combinazione di metodi di ionizzazione a pressione atmosferica (API) con spettrometria di massa tandem ha aperto questa tecnologia all’arena del laboratorio clinico. La novità di questa tecnologia sembra essere simile a quella dei saggi immunologici negli 1970 e della reazione a catena della polimerasi, o PCR, negli 1980.1 La spettrometria di massa tandem ha trovato la sua strada nei laboratori clinici nei primi anni 1990, con l’analisi di acilcarnitine e aminoacidi da macchie di sangue neonatali. Negli ultimi dieci anni, la cromatografia liquida tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) ha svolto un ruolo sempre più importante nell’analisi clinica. È comune ora trovarlo nei laboratori con applicazioni per endocrinologia, tossicologia, farmacologia e monitoraggio terapeutico dei farmaci. Man mano che i prezzi per i sistemi LC-MS/MS di base diminuiscono, più laboratori clinici si avventureranno in questa tecnologia.

Panoramica di LC-MS/MS

La spettrometria di massa misura il rapporto massa-carica (m/z) di una molecola, che è stata ionizzata, e dei suoi ioni frammento. Uno spettro di massa è la trama di m / z rispetto all’intensità di ioni o all’abbondanza di ioni.2 Uno spettrometro di massa tandem ha due dispositivi selettivi di massa (quadrupoli) disposti in una serie che seleziona lo precursor precursore (di un particolare m/z) del rispettivo analita, che viene quindi diretto in una cella di collisione dove un flusso molto basso di un gas di collisione è responsabile della disintegrazione degli ioni precursori in diversi ioni prodotto. Il secondo quadrupolo posizionato dietro la cella di collisione viene utilizzato per scansionare gli ioni del prodotto che si formano in base al rispettivo rapporto m/z.

La cella di collisione stessa può rappresentare un piccolo quadrupolo; quindi, il termine spettrometro di massa triplo quadrupolo può essere usato come sinonimo. Per la quantificazione con LC-MS / MS, dopo la separazione LC del rispettivo analita, le molecole vengono introdotte nello spettrometro di massa tramite API, che consente la formazione di ioni. Esistono due tecniche di ionizzazione primaria, la ionizzazione elettrospray (ESI) e la ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI). L’uso di ESI è principalmente per l’analisi delle specie caricate; mentre, APCI è utilizzato per le specie non caricate o difficili da caricare. ESI è un processo di ionizzazione” soft ” (energia molto bassa), che di solito produce la molecola madre intatta con una o più cariche.

Punti di forza di LC-MS / MS

Specificità: La selezione dello precursor precursore con il primo quadrupolo e dello product del frammento del prodotto con il secondo quadrupolo dallo spettrometro di massa tandem può esibire la rilevazione altamente specifica per una determinata molecola.

Ampia gamma di applicazioni: A differenza di GC / MS, l’applicazione di LC-MS / MS non è limitata alle molecole volatili (di solito con pesi molecolari inferiori a 500 Da). Poiché la maggior parte delle molecole biologicamente attive sono polari, termolabili e non volatili, LC-MS/MS è meglio orientata verso la rilevazione di tali molecole. Inoltre, la preparazione del campione è di solito semplice e non richiede tecniche di derivatizzazione. I test LC-MS/MS sono generalmente ottimizzati per tempi di esecuzione più brevi; pertanto, è possibile ottenere un throughput del campione molto più elevato rispetto a GC / MS.

Flessibilità: i nuovi test possono essere tipicamente sviluppati internamente (“home brew”) con un alto grado di flessibilità e in breve tempo, a condizione che venga eseguita una convalida completa del test.

Abbondanza di informazioni: Una singola esecuzione analitica LC-MS/MS, grazie alla rapida elettronica di selezione ionica, analisi multi-parametriche, quasi parallele con lo spettrometro di massa, può produrre un gran numero di risultati quantitativi o qualitativi.

Campi di applicazione

Screening neonatale: L’incursione iniziale di LC-MS / MS nell’arena clinica è stata la sua applicazione allo screening neonatale degli errori congeniti del metabolismo.3 Attualmente, in molti paesi industrializzati, LC-MS / MS viene utilizzato nello screening neonatale di routine per errori congeniti del metabolismo. Allo stato attuale, lo screening neonatale nelle macchie di sangue essiccato comprende più di 30 malattie, tra cui acidemie organiche, aminoacidopatie e difetti di ossidazione degli acidi grassi. Inoltre, la spettrometria di massa tandem è stata utilizzata per schermare altri metaboliti come gli oligosaccaridi delle urine, 4 sulfatidi, 5 acidi grassi a catena molto lunga, 6 acidi biliari a catena lunga, 7 acido metilmalonico,8 e per lo studio della porfiria9 e lo screening per i pazienti a rischio di disturbi ereditari del metabolismo delle purine e della pirimidina.10

Monitoraggio terapeutico dei farmaci: Lo sviluppo dell’immunosoppressore sirolimus (rapamicina) per la prevenzione dei rifiuti di organi dopo il trapianto è stato lo stimolo principale dietro l’introduzione di LC-MS/MS nel laboratorio clinico. Sono disponibili metodi LC-MS/MS per la determinazione simultanea di tacrolimus, sirolumus e ciclosporina.11 Metodi LC-MS / MS sono disponibili per una varietà di classi di farmaci come farmaci citotossici,12 farmaci antiretrovirali,13 antidepressivi triciclici,14 anticonvulsivanti,15 antiepilettici16 … . Mentre l’azionamento verso il dosaggio più individualizzato della droga continua, l’analisi di LC-MS/MS di queste classi della droga diventerà sempre più routine.

Test di abuso e gestione del dolore: GC/MS è ancora la tecnica più utilizzata per i test tossicologici; tuttavia, LC-MS/MS sta guadagnando terreno in quell’area a causa della semplice preparazione del campione, dell’assenza di requisiti di derivatizzazione e dei tempi di esecuzione più brevi. È stato riportato lo screening diretto dei farmaci dalle urine17 e sono disponibili metodi per i gruppi multidrug per lo screening dei farmaci d’abuso, 18 e per la conferma delle benzodiazepine, 19 la misurazione di numerosi farmaci come la buprenorfina e i suoi metaboliti, 20 anfetamine,21 oppioidi.22

Endocrinologia e test sugli steroidi: i test radioimmunologici e immunoenzimatici erano le principali tecniche per la misurazione degli steroidi nei laboratori clinici. I saggi immunologici soffrono di molte limitazioni come la mancanza di specificità, la gamma dinamica limitata e gli effetti della matrice. L’avvento di LC-MS / MS è visto come una tecnologia analitica innovativa applicabile a un ampio numero di analisi nel laboratorio di endocrinologia, principalmente la quantificazione di vari steroidi. L’analisi di 25 (OH) livelli di vitamina D3 e D2 da LC-MS/MS sta guadagnando slancio,23 e LC-MS/MS metodi sono stati sviluppati per una varietà di steroidi come il testosterone, aldosterone, cortisolo, progesterone, estriolo… .24

Sfide

La tecnologia LC-MS / MS deve superare alcune sfide prima di passare da una tecnica specializzata e tecnicamente complessa a test di laboratorio clinici tradizionali. Sebbene la strumentazione sia diminuita in termini di prezzo e complessità, rimangono sfide come lo sviluppo di saggi, la standardizzazione di saggi su tutta la linea e la formazione e il mantenimento di personale tecnico altamente qualificato.

Sviluppo e convalida del metodo: La maggior parte dei metodi LC-MS/MS utilizzati nel laboratorio clinico può essere collocata sotto la categoria di test sviluppata in laboratorio, poiché erano ” fatti in casa.”I laboratori che implementano questa tecnologia dovrebbero sviluppare il test e intraprendere una convalida approfondita prima di mettere questi test in uso di routine. I laboratori sono tenuti a preparare in casa o acquisire commercialmente standard di alta qualità, standard interni deuterati e materiali per il controllo della qualità. Gli sforzi sono in corso da parte delle aziende manifatturiere per presentare Food and Drug Administration – (FDA -) kit di test approvati per l’uso da parte del laboratorio clinico. Il primo kit di questo tipo è stato il Waters MassTrak Immunosoppressants kit (Waters, Milford, MA) che è stato autorizzato dalla FDA per la quantificazione dell’immunosoppressore Tacrolimus (FK506; Prograf) in campioni di sangue intero di pazienti sottoposti a trapianto di fegato e rene come aiuto nella gestione della terapia con tacrolimus. Man mano che i kit simili diventano approvati dalla FDA e man mano che diventano disponibili più calibratori commerciali, materiali per il controllo della qualità e standard, questi contribuiranno ad alleviare alcune delle sfide l’uso diffuso di LC-MS/MS nei laboratori clinici.

Standardizzazione: Il vantaggio di misure altamente specifiche è compensato da differenze tra laboratorio tra i vari metodi LC-MS/MS poiché la maggior parte sono “fatti in casa.”La mancanza di standardizzazione e armonizzazione nella spettrometria di massa è una sfida importante che deve essere superata per un uso più diffuso di questa tecnologia nei laboratori clinici. Gli sforzi sono in corso per standardizzare alcuni metodi LC-MS / MS come testosterone e vitamina D. La Società endocrina e i Centri per il controllo e la prevenzione delle malattie sono usciti all’inizio del 2010 con una dichiarazione di consenso per garantire test di testosterone altamente accurati che si tradurranno in una migliore diagnosi, trattamento e prevenzione delle malattie attraverso25 Questo sforzo mira a raggiungere la misura altamente accurata ed affidabile del testosterone facendo uso sia di LC-MS / MS che dei saggi immunologici. Nel Regno Unito, è disponibile uno schema di test di competenza esterno per l’analisi della vitamina D-denominato DEQAS, per lo schema di garanzia della qualità esterna della vitamina D. L’obiettivo generale di DEQAS è quello di garantire l’affidabilità analitica dei saggi 25 idrossivitamina D (25OHD) e 1,25 diidrossivitamina D (1,25(OH)2D).

Competenza tecnica: La formazione e il mantenimento di personale altamente qualificato sono necessari non solo per lo sviluppo e la convalida del metodo, ma anche per il funzionamento quotidiano. Il talento a livello di dottorato potrebbe essere necessario per implementare i test e per la risoluzione dei problemi, ma non per le operazioni quotidiane dello spettrometro di massa.

I tecnologi di laboratorio con esperienza in spettrometria di massa sono più che in grado di gestire le operazioni quotidiane; tuttavia, trovare tale esperienza è difficile. Al fine di portare il personale di laboratorio al passo con la spettrometria di massa, l’American Association for Clinical Chemistry ha istituito un nuovo programma di certificati di nove corsi nell’utilizzo della spettrometria di massa tandem nel laboratorio clinico.

Charbel Abou-Diwan, PhD
, è un post-dottorato di chimica clinica presso il dipartimento di Patologia presso la Emory University School of Medicine, Atlanta GA.

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