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Despertar la vía Leloir endógena para una utilización eficiente de la galactosa por Yarrowia lipolytica

La levadura Y. lipolytica es capaz de utilizar unos pocos monosacáridos como fuentes de carbono, a saber, glucosa, fructosa y manosa . Sin embargo, a diferencia de S. cerevisiae, ninguna de las cepas de Y. lipolytica WT es capaz de utilizar galactosa pura.

Genes estructurales y reguladores de la vía Leloir en Yarrowia lipolytica

Se examinó la conservación de las proteínas de la vía Leloir. La nomenclatura propuesta de los genes ylGAL se utilizará en este documento de la siguiente manera: ylGAL1 (YALI0C13090g, galactocinasa), ylGAL7 (YALI0F23947g, galactosa-1-fosfato uridil transferasa), ylGAL10E (YALI0E26829g, UDP-glucosa-4 Epimerasa) e ylGAL10M (YALI0C09570g, galactosa Mutarotasa). En Y. lipolytica, la UDP-glucosa-4 epimerasa (ylGAL10E) es la proteína GAL más conservada que también se encuentra en S. cerevisiae y H. jecorina (69-76% de similitud de aminoácidos), mientras que la galactosa mutarotasa (ilGAL10 M) es la menos conservada (36-42% similar) (Tabla 1; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Aunque los genes estructurales necesarios para la utilización de galactosa están presentes en Y. lipolytica, no se encontraron los genes que codifican proteínas reguladoras en S. cerevisiae (es decir, scGAL3, scGAL4 y scGAL80). Además, los sitios de unión a GAL4 no están presentes en las regiones promotoras de los genes ilGAL (datos no mostrados), lo que también es el caso de H. jecorina . A pesar de este hecho, H. jecorina es capaz de crecer bien con galactosa. Trabajos anteriores han demostrado que la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe también contiene todos los genes Leloir, pero no crece cuando la galactosa es la única fuente de carbono disponible . El gen MIG1 (YALI0E07942g), cuyo homólogo reprime la expresión de genes GAL en S. cerevisiae, ha sido identificado en Y. lipolytica . La interrupción de ylMIG1 no dio lugar al crecimiento de Y. lipolytica en galactosa (datos no mostrados).

Tabla 1 Comparación de genes GAL entre Y. lipolytica, S. cerevisiae y H. jecorina

Los genes de Yarrowia lipolytica GAL se expresan

Para examinar la expresión génica de ylGAL, Y. lipolytica se cultivó en un medio de glucosa al 1,0% seguido de su transferencia a un conjunto de medios que contenían dos concentraciones diferentes (0,1 y 1,0 %) de tres monosacáridos diferentes (galactosa, glucosa y manosa), y se realizaron análisis de transcripción (Fig. 2a; para más detalles, consulte «Métodos»). La galactosa era el compuesto objetivo, la glucosa era un represor potencial, y la manosa era un azúcar neutro en la represión de catabolitos. Los tres genes ylGAL principales (ylGAL1, ylGAL7, ylGAL10E) se expresaron bajo todas las condiciones, pero ylGAL10M, el gen menos importante en la utilización de galactosa, mostró una expresión muy débil (Fig. 2a). Este patrón es similar al observado en H. jecorina . Debido a que los genes ylGAL se expresaron cuando Y. lipolytica se cultivó en glucosa, parece que no están sujetos a represión catabólica como lo están en S. cerevisiae . Un patrón similar se observó en A. niger, que muestra un crecimiento deficiente en galactosa, a pesar de que todos sus ortólogos Leloir se expresan en todas las fuentes de carbono estudiadas .

Fig. 2
figura 2

Perfiles de expresión de genes ylgales en Y. lipolytica W29. Las células crecieron primero durante 16 h en medio de YNB con 1,0% de glucosa y luego se incubaron durante 3-24 h en medio de YNB que contenía el azúcar indicado a 0,1 o 1,0 %. La RCP-RT de punto final se realizó después de 3 h de incubación en glucosa, manosa o galactosa (a). La cinética de la expresión de genes ILGALES se monitoreó mediante RT-PCR cuantitativa en Y. lipolytica W29 incubada en medio YNB que contenía 1,0% de glucosa (b), 1,0% de galactosa (c) o una mezcla de 1.0% de glucosa y 1,0% de galactosa (d). Los niveles de expresión génica se normalizaron en función de los niveles de expresión del gen de actina (ΔC T). En inóculo

Dado que los genes ylGAL no fueron reprimidos por la glucosa, se realizó un análisis cinético de su expresión cuantitativa en glucosa, galactosa y mezcla de ambas (Fig. 2b–d). Los perfiles genéticos muestran que, en la glucosa, la expresión del gen UDP-glucosa-4-epimerasa (ylGAL10E) fue constante, mientras que la expresión de los genes galactocinasa (ylGAL1) y galactosa-1-fosfato uridil transferasa (ylGAL7) aumentó después de 24 h (Fig. 2b). Una vez más, el gen de la galactosa mutarotasa (ilGAL10M) tuvo los niveles de expresión más bajos. En galactosa, hubo un ligero aumento en la expresión de genes ylGAL (ylGAL1, ylGAL7, ylGAL10E) con el tiempo: alcanzó entre 2,7 y 4,6 después de 24 h (Fig. 2c). Por lo tanto, los genes ILGALES se regularon al alza en presencia de galactosa. La expresión de genes ylgales en la mezcla de glucosa al 1,0% y galactosa al 1,0% (Fig. 2d) se asemejaba al perfil de expresión de estos genes en glucosa al 1,0% (Fig. 2b), excepto para el gen ylGAL10E, que se reguló más de 10 veces por la presencia de galactosa en el medio (Fig. 2d). Este resultado indica que en Y. lipolytica, los genes ylGAL no están sujetos a la represión de catabolitos de glucosa, ya que ylGAL10E puede regularse al alza por galactosa también en presencia de glucosa. En A. nidulans y H. también se ha notificado que jecorina, galD (GAL7) y galE (GAL1) se regularon al alza en presencia de galactosa versus glucosa . Sin embargo, a diferencia del gen ylGAL10E, que también está regulado por galactosa, la expresión de su homólogo GAL10 de H. jecorina no mejora con este azúcar .

Los genes de Yarrowia lipolytica GAL son funcionales

Para investigar la actividad de las proteínas codificadas por los genes de Y. lipolytica GAL, se realizó una prueba de complementación funcional utilizando S. cerevisiae. Los genes ylGAL se amplificaron y clonaron en un vector PRS426 multicopia bajo el control del promotor scTEF. Los transformantes de S. cerevisiae obtenidos se probaron posteriormente para determinar si podían crecer cuando la galactosa era la única fuente de carbono (Fig. 3). Los tres genes ylGAL clonados, ylGAL1, ylGAL7 e ylGAL10E, complementaron sus mutantes de deleción de GAL de S. cerevisiae correspondientes y restauraron el crecimiento en galactosa. Este resultado muestra que los genes ilGAL codifican proteínas Leloir funcionales. El hecho de que la S. el mutante de cerevisiae (agotado para las funciones de epimerasa y mutarotasa) que expresa solo el gen ylGAL10E demostró crecimiento, mientras que el mutante que expresa el gen ylGAL10M no confirmó lo que Seiboth et al. encontrado: que la actividad de la epimerasa, no la mutarotasa, de scGAL10 es necesaria para que S. cerevisiae pueda usar galactosa como única fuente de carbono . Debido a que la galactoquinasa de K. lactis demuestra dos actividades-actúa como una enzima y una proteína reguladora-también se examinó la supuesta función reguladora de la galactoquinasa de Y. lipolytica. El gen ylGAL1p, que complementaba a la S. mutante de cerevisiae ΔGAL1, no fue capaz de restaurar el crecimiento normal en galactosa para el mutante de S. cerevisiae ΔGAL3 (Fig. 3), en contraste con su contraparte K. lactis . ScGAL3, que es un ohnolog de scGAL1, divergió después de un evento de duplicación del genoma completo, perdiendo la actividad enzimática del gen ancestral, pero conservando su función reguladora. Este hallazgo sugiere que ylGAL1 no comparte el papel regulador de scGAL3; esta función se perdió en Y. lipolytica en el curso de la evolución, o se adquirió más tarde en hemiascomicetos (quizás en la base de la rama de Saccharomycetaceae).

Fig. 3
figura 3

Complementación de la deleción del gen GAL en S. cerevisiae utilizando homólogos GAL encontrados en Y. lipolytica. Cepas EV complementadas para la eliminación de uracilo utilizando un vector vacío pRS426TEF

Validación de la funcionalidad de la vía Leloir en Yarrowia lipolytica

Dada la evidencia de que la vía Leloir era potencialmente funcional en Y. lipolytica, se investigó la utilización de galactosa por la especie (Fig. 4). Los genes ilgales se expresaban cuando la levadura se cultivaba con glucosa, pero la galactosa por sí sola no permitía el crecimiento. Como resultado, se analizó el crecimiento y el consumo de azúcar de Y. lipolytica W29 (la cepa silvestre) en medio de YNB que contenía una mezcla de glucosa y galactosa (0,1 o 1,0%). En primer lugar, se realizó un experimento de control en el que se examinó el crecimiento y el consumo de azúcar en glucosa versus galactosa. Como era de esperar, cuando la galactosa era la única fuente de carbono, no se consumía, mientras que el 0,1% y el 1,0% de glucosa se agotaban en 12 y 32 h, respectivamente (Fig. 4a, c). Sorprendentemente, cuando la misma cepa se cultivó en un medio que contenía tanto glucosa al 0,1 % como galactosa al 0,1%, pudo usar ambos azúcares (Fig. 4b). La tasa de utilización específica de glucosa fue la misma que para el cultivo de solo glucosa (0,60 ± 0,04 g/g/h). En contraste, la tasa de utilización de galactosa específica alcanzó un valor diez veces menor que la de glucosa (0,060 ± 0,005 g/g / h) y se mantuvo constante durante el proceso. Además, el consumo de azúcar también se probó utilizando cultivos que contenían concentraciones más altas de ambos monosacáridos (1 %) para eliminar la influencia de cualquier sensor de azúcar putativo, que podría cambiar el metabolismo del carbono (Fig. 4d). Al igual que en el experimento anterior, Y. lipolytica W29 usó glucosa y galactosa desde el principio, pero la tasa de consumo de glucosa fue mucho mayor que la tasa de consumo de galactosa (0.15 ± 0.01 g/g/h versus 0.030 ± 0.003 g/g/h, respectivamente). Vale la pena señalar que la galactosa no solo fue consumida por las células, sino que también se utilizó parcialmente para la producción de biomasa (Fig. 4b, d). Además, la deleción del gen ylGAL10E resultó en una disminución dramática del consumo de galactosa (archivo adicional 1), indicando la participación de la vía Leloir en la utilización de galactosa.

Fig. 4
figura 4

Cambios en la concentración de azúcares y crecimiento durante cultivos de Y. lipolytica W29 en medio YNB con glucosa y galactosa. un medio de YNB con glucosa única al 0,1 % o 0.galactosa al 1%, b YNB medio con mezcla de glucosa al 0,1% y galactosa al 0,1%, c YNB medio con glucosa al 1% o galactosa al 1%, d YNB medio con mezcla de glucosa al 1% y galactosa al 1%. Glucosa (diamante relleno), galactosa (cuadrado relleno), densidad óptica de células que crecen en cultivos con glucosa (triángulo relleno), galactosa (círculo relleno), mezcla de glucosa y galactosa (triángulo sin relleno)

Por lo tanto, el siguiente paso fue determinar la concentración de glucosa que Y. lipolytica requiere para poder usar galactosa. Y. por lo tanto, lipolytica W29 se cultivó en un conjunto de medios que contenían 1,0% de galactosa y un rango de glucosa, de 0,1 a 1,0 %. A una concentración de glucosa del 0,1 %, el crecimiento fue muy débil y no se consumió galactosa (Fig. 5a). A concentraciones de glucosa más altas (0,2–0,4 %), también se utilizó una pequeña cantidad de galactosa; sin embargo, después de agotar la glucosa, se detuvo el consumo de galactosa (Fig. 5b, c). A concentraciones de glucosa aún más altas, Y. lipolytica consumió galactosa de manera más eficiente, después de un breve retraso (Fig. 5d-f). El consumo de galactosa aumentó una vez que la glucosa había sido drenada del medio, que es también cuando las células entran en la fase estacionaria (Fig. 5d-f). El hecho de que Y. lipolytica necesita concentraciones de glucosa superiores al 0,4% para usar galactosa de manera eficiente sugiere que primero requiere acceso a una fuente de carbono metabólicamente favorable que promueva el crecimiento y la viabilidad antes de poder usar galactosa. Este fenómeno podría resultar porque Y. la lipolítica es estrictamente aeróbica, y la gran cantidad de energía requerida para sintetizar proteínas Leloir no se puede adquirir cuando la levadura comienza su crecimiento en galactosa. En S. cerevisiae expuesto a condiciones de oxígeno limitado, cuando la levadura se cambia de glucosa a galactosa, los niveles de energía caen rápidamente y las proteínas Leloir no se sintetizan en cantidades suficientes para hacer posible la utilización de galactosa . Sin embargo, esta explicación para el fenotipo observado de Y. lipolytica debe investigarse más a fondo.

Fig. 5
figura 5

Comparación del crecimiento y utilización de azúcar de Y. lipolytica W29 en medio de YNB con 1% de galactosa y diferente concentración de glucosa: 0,1% (a); 0,2 % (b); 0,4 % (c); 0,6 % (d); 0,8 % (e); 1,0 % (f). Glucosa (diamante relleno), galactosa (cuadrado relleno), OD600 (triángulo relleno)

La sobreexpresión de todos los genes de Yarrowia lipolytica GAL induce un crecimiento eficiente en galactosa

Porque Y. se encontró que los genes GAL de lipolítica eran funcionales, el objetivo fue ver si era posible mejorar la vía Leloir de tal manera que Y. lipolytica pudiera usar eficientemente galactosa como única fuente de carbono. Todos los genes ylgales se colocaron bajo el control del fuerte promotor constitutivo de TEF y se introdujeron individualmente o en varias combinaciones en el fondo PO1d de Y. lipolytica. Las cepas resultantes se probaron para ver si podían crecer solo con galactosa. Cuando los transformantes se cultivaron con glucosa, mostraron un crecimiento normal y sin cambios morfológicos, lo que sugiere que su fisiología no se vio afectada (Fig. 6a). Solo los mutantes en los que la ylGAL1, la ylGAL7 y la ylGAL10E estaban sobreexpresadas simultáneamente podían crecer en 48 h con galactosa al 0,1 y al 1,0% (Fig. 6a, línea 12). La actividad de la mutarotasa, que no es necesaria para el metabolismo de la galactosa, sin embargo, pareció mejorar ligeramente la utilización de la galactosa (Fig. 6a, línea 15). Curiosamente, la sobreexpresión de todos los genes Leloir de S. cerevisiae en Y. lipolítica no fue eficiente y resultó en un crecimiento débil y retardado (archivo adicional 2A). El análisis adicional de los patrones de crecimiento mostró que los transformantes de Y. lipolytica sobreexpresan los genes ylGAL, con la excepción de Y4585 e Y4588, tardaron mucho tiempo en crecer en galactosa. La cepa Y4577, en la que se sobreexpresaron ylGAL1 e ylGAL7, mostró un crecimiento visible después de 2 semanas de incubación, pero reveló una morfología normal en placas (archivo adicional 2B). Este hecho apoya la observación de que la expresión nativa de ylGAL10E es más alta que la del resto de los genes ylGAL, pero necesita tiempo para alcanzar un nivel eficiente. Además, la cepa Y4578, en la que ylGAL1 e ylGAL10E estaban sobreexpresadas, también mostró un crecimiento visible después de 2 semanas de incubación, aunque mucho menos eficiente que Y4577 (archivo adicional 2B). Este hallazgo subraya que la expresión de ylGAL7 da lugar a la biosíntesis funcional de proteínas, pero no a niveles normales para la utilización de galactosa en toda la población celular.

Fig. 6
figura 6

Análisis funcional de la sobreexpresión de la vía Leloir en Y. lipolytica y cambio de pliegue en la expresión de los genes ylGAL. Crecimiento de diferentes transformantes de Y. lipolytica sobreexpresando genes ylGAL y scGAL en placas de medio YNB que contienen glucosa o galactosa-incubación a 28 ° C, 48 h (a). Cambios de pliegue en la expresión de genes ylGAL en el mutante cuádruple, Y4588 (en el que todos los genes Leloir estaban sobreexpresados), en relación con Y. lipolytica W29 (la cepa de tipo silvestre) (b); la levadura se incubó durante 3 h en medio YNB que contenía 0.1 o 1,0% de galactosa. Los niveles de expresión génica se normalizaron en función de la expresión del gen de actina

El fuerte aumento de la expresión génica en el mutante cuádruple (Y4588) mostró que, cuando las concentraciones de galactosa eran bajas, cada gen estaba sobreexpresado en comparación con la cepa parental; por ejemplo, la expresión fue 400 veces mayor para ylGAL10M (Fig. 6b). Sorprendentemente, cuando las concentraciones de galactosa eran altas (1,0 %), el cambio en los niveles de expresión génica no era tan agudo, especialmente en el caso de ylGAL10E. La cepa parental expresa ylGAL10E en niveles altos cuando se cultiva en galactosa al 1,0%, lo que podría explicar por qué la sobreexpresión de este gen en particular no aumentó los niveles de transcripción (Fig. 6b). La sobreexpresión de los cuatro genes ylGAL activó eficientemente la vía Leloir y creó una cepa que puede usar galactosa como única fuente de carbono.

La cinética de utilización del azúcar y la expresión de los transportadores en Yarrowia lipolytica sobreexpresando genes ylgales

La glucosa debe estar presente en el medio de cultivo para el Y. cepa de tipo salvaje lipolítica (W29) para poder utilizar galactosa. La sobreexpresión de todos los genes en la vía Leloir permitió que las células de Y. lipolytica crecieran en medios cuya única fuente de carbono era la galactosa. El siguiente paso fue determinar si la glucosa tenía un efecto sobre la utilización de galactosa en el mutante cuádruple de Y. lipolytica (Y4588). Para ello, se caracterizó su crecimiento y utilización de azúcar en glucosa al 1%, galactosa al 1% y una mezcla de glucosa al 1% y galactosa al 1%. La cinética de consumo de azúcar fue la misma cuando la cepa se cultivó en los cultivos individuales de azúcar, alcanzando una tasa de consumo específica de 0,13-14 ± 0,01 g/g / h; se produjo un poco más de biomasa cuando la cepa se cultivó solo con glucosa (Fig. 7a). Sin embargo, la dinámica de utilización del azúcar cambió en el medio mixto (Fig. 7b). Durante la fase de crecimiento exponencial, las tasas de utilización específicas de glucosa y galactosa fueron de 0,13 ± 0,01 y 0,040 ± 0,003 g/g / h, respectivamente, mientras que durante la fase estacionaria, ambos valores disminuyeron a 0,020 ± 0,001 y 0,030 ± 0.003 g/g / h para glucosa y galactosa, respectivamente. Este mismo patrón también se observó en concentraciones más bajas de ambos azúcares (0,1 y 0,5%, respectivamente; no se muestran datos). En general, el crecimiento y el consumo de azúcar fueron los mismos en los medios de solo glucosa y de azúcar mixta; por ejemplo, a las 18 h de incubación, el consumo fue de alrededor de 5,5 a 6 g/L para ambos (Fig. 7). A pesar de que la vía de utilización de galactosa se había activado claramente, la glucosa era obviamente la fuente de carbono preferida.

Fig. 7
figura 7

Yarrowia lipolytica Y4588 crecimiento y consumo de azúcar durante 48 h en medio YNB que contenga solo 1% de glucosa, solo 1% de galactosa (a), o una mezcla de glucosa al 1% y galactosa al 1% (b). Glucosa (diamante relleno), galactosa (cuadrado relleno), OD600 en glucosa (triángulo relleno), OD600 en galactosa (círculo relleno) y OD600 en la mezcla de ambos azúcares (x)

El transporte de galactosa dentro de la célula es el primer paso en el proceso metabólico. Puede modificarse en el mutante cuádruple o puede verse afectado por la presencia de glucosa. En Y. lipolytica, se han identificado seis genes como transportadores de hexosa de una familia similar a HXT; se han nombrado en series, YHT1 a YHT6, y se ha informado que transportan galactosa (Lazar et al. en preparación; ). La eficiencia de absorción de galactosa y glucosa se comparó en mutantes nulos hxt de S. cerevisiae transformados con cada uno de estos seis genes (archivo adicional 3A). Cuatro de los transportadores, YHT1–YHT4, permitieron un consumo significativo de galactosa o glucosa; sin embargo, la eficiencia de absorción varió (archivo adicional 3A). Solo dos de los transportadores, YHT1 e YHT4, se expresaron en niveles altos en la cepa Y. lipolytica Y4588 cultivada en glucosa al 1% o galactosa al 1%, de manera similar a la cepa W29 (WT) (archivo adicional 3B). Estos hallazgos sugieren que este conjunto de transportadores de galactosa no se ve afectado ni por el fondo genético (WT o Y4588) ni por la fuente de carbono. Debido a que el consumo de galactosa fue mucho más lento en presencia de glucosa, se puede plantear la hipótesis de que el transporte de galactosa se inhibió de alguna manera debido a la competencia con la glucosa, incluso si su expresión no fue reprimida. Sin embargo, no se pueden excluir interacciones potenciales entre el metabolismo de la glucosa y el metabolismo de la galactosa.

La galactosa es un buen sustrato para procesos industriales que utilizan Yarrowia lipolytica

Para confirmar que la galactosa podría usarse eficazmente en aplicaciones industriales (por ejemplo, la Y. la cepa lipolytica Y4588 podía producir de manera eficiente ácido cítrico y lípidos), los cultivos por lotes se criaron en frascos y biorreactores. Todos los resultados de la producción de biomasa, ácido cítrico y lípidos se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2 Producción de biomasa, ácido cítrico y lípidos

Las cepas de Y. lipolytica de tipo salvaje (W29) y cuádruple mutante (Y4588) produjeron cantidades similares de biomasa (~11 g/L) cuando se cultivaron en medios de glucosa y galactosa con una relación C/N de 60. Rendimiento de biomasa varió de 0.19 a 0,24 g/g. Cuando la relación C/N del medio de galactosa aumentó a 100, el rendimiento de biomasa disminuyó ligeramente (11%).

Curiosamente, en la glucosa, la biosíntesis de ácido cítrico y el rendimiento fueron alrededor de cuatro veces más altos para Y4588 que para W29. Además, Y4588 fue capaz de producir tres veces más ácido cítrico a partir de galactosa (C/N 60) que W29 cultivado en glucosa. Finalmente, cuando la relación C/N se incrementó a 100, el rendimiento de biomasa y ácido cítrico de galactosa aumentó en un 55 y un 37 %, respectivamente.

La galactosa también se puede utilizar para producir lípidos de manera eficiente. En la glucosa con una relación C/N de 60, W29 e Y4588 produjeron cantidades similares de lípidos totales. Y4588 fue capaz de producir cantidades comparables de lípidos totales en medios de solo galactosa y glucosa (Tabla 2). Los rendimientos lipídicos para W29 e Y4588 oscilaron entre 0,034 y 0,041 g/g. Además, el aumento de la relación C/N a 100 mejoró la acumulación de lípidos en un 20 %; alcanzó 0,212 g/g. W29 tuvo rendimientos similares o menores cuando se cultivó en medios de glucosa o fructosa con la misma relación C / N.

Para estudiar la capacidad de Y4588 para producir ácido cítrico y lípidos en grandes cantidades, el proceso se amplió mediante el uso de biorreactores de 2 L; este enfoque se basó en resultados anteriores obtenidos para cultivos de matraz de galactosa (relación C/N de 100). En general, la producción de biomasa, ácido cítrico y lípidos mejoró drásticamente (Tabla 2). En estas condiciones se produjeron hasta 19,4 g/L de biomasa, lo que representa un aumento del 100 %. La producción de ácido cítrico alcanzó los 29,2 g / L y, por lo tanto, la conversión del sustrato a ácido cítrico mejoró en un 31 %. Además, la producción de lípidos aumentó de 1,79 a 3,22 g/L, lo que significa que un 34% más de galactosa se convirtió en lípidos. La construcción de una cepa de Y. lipolytica capaz de producir ácido cítrico y lípidos a partir de galactosa es un paso muy importante para evitar problemas relacionados con el uso de sustratos a base de alimentos en aplicaciones industriales. Además, será importante activar la vía Leloir en una cepa optimizada para que la acumulación de lípidos alcance un título tan alto de biolípidos de galactosa como lo reportaron recientemente Qiao et al. de glucosa . Activación de la vía Leloir en una cepa descrita recientemente por Lazar et al. actualmente está en curso.

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